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Troubleshooting
Tailende Peaks, veränderte Retentionszeiten, Druckschwankungen oder fehlendes Detektorsignal - Dies und noch vieles mehr sind alles Fälle, die im Alltag des Analytikers nicht erwünscht sind, jedoch trotzdem hin und wieder auftreten.
Um Ihnen bei der Fehlersuche und deren Behebung eine Hilfestellung zu geben, haben einige Hersteller sehr hilfreiche Broschüren zum Thema Troubleshooting erstellt, die Ihnen eine gute Übersicht über mögliche Fehlerquellen und deren Behebung im HPLC-Alltag geben. Zu den häufigsten Problemen finden Sie im folgenden mögliche Ursachen und Lösungen.
Für Fragen und Unterstützung zum Thema Fehlerbehebung stehen wir Ihnen gern zur Verfügung.
Technische Daten
Peak Tailing
Peak Tailing ist eins der häufigsten Probleme in der HPLC. Dabei kann das Problem verschiedene Ursachen haben. Wichtig dabei ist zu unterscheiden, ob das Problem alle Peaks betrifft oder nur einzelne. Sind alle Peaks betroffen, weist dies auf ein physikalisches Problem in der Anlage oder der Säule hin. Das kann Totvolumen, eine blockierte Fritte oder ähnliches sein. Sind nur einzelne Peaks betroffen weist dies auf chemische Probleme hin, wie z.B. das Tailing von Basen auf älteren Säulen.
| Beobachtung | Mögliche Ursache | Lösung/Vorbeugung |
|---|---|---|
| Peak Tailing bei Basen | Unerwünschte Wechselwirkung von Basen mit aktiven Silanolen | 1. Eine modernere Phase verwenden, um aktive Silanole zu reduzieren 2. Basische Additive in die mobile Phase geben, um Silanole zu maskieren (nicht notwendig bei modernen Phasen) |
| Peak Tailing bei Analyten, die mit Metallen Chelatkomplexe bilden können | Unerwünschte Wechselwirkung von Analyten mit Metallen in der stationären Phase | 1. Eine moderne Phase verwenden, um Metalle zu reduzieren |
| Peak Tailing bei ionischen/ionisierbaren Analyten | Nicht passender pH-Wert in der mobilen Phase führt zu unerwünschten Wechselwirkungen mit geladenen Silanolen | 1. pka-Werte der Analyten prüfen und pH-Wert so wählen, dass der Analyt vollständig geladen oder neutral vorliegt 2. pH-Wert von 2.5 verwenden, damit die Silanole ungeladen vorliegen, um dadurch ionische Wechselwirkungen zu verhindern |
| Peak Tailing bei allen Peaks | Blockierte Fritte | 1. Säule umgekehrt Spülen (bitte vorher Herstellerinformationen beachten) 2. Inline Filter verwenden |
| Peak Tailing bei allen Peaks | Void Bildung in der Säule | 1. Säule umgekehrt Spülen (bitte vorher Herstellerinformationen beachten) 2. Säule ersetzen |
| Peak Tailing bei allen Peaks | Totvolumen in der Anlage | 1. Alle Verbindungen überprüfen (Fittinge, korrektes zuschneiden von Kapillaren) 2. Anzahl der Verbindungen reduzieren 3. Kürzere Kapillaren verwenden |
Peak Fronting
Neben dem Peak Taililng ist Fronting die zweite Abweichung von der idealen Gauß-Form eines Peaks. Dabei tritt das Fronting nicht so häufig auf wie das Tailing. Der häufigste Grund für ein Fronting sind zu große Injektionsvolumina und ein nicht passendes Lösungsmittel für die Injektion.
| Beobachtung | Mögliche Ursache | Lösung/Vorbeugung |
|---|---|---|
| Peak Fronting bei allen Peaks | Injektionsvolumen oder Konzentration zu hoch, dadurch kann nicht jeder Analyt mit der stationären Phase wechselwirken und wird schneller eluiert | 1. Injektionsvolumen reduzieren 2. Konzentration das Analyten verringern |
| Peak Fronting bei allen Peaks | Injektionslösungsmittel ist nicht kompatibel mit der mobilen Phase (zu stark oder nicht mischbar) | 1. Mobile Phase als Injektionslösungsmittel verwenden 2. Injektionslösungsmittel verwenden, welches schwächer als die mobile Phase ist |
| Peak Fronting bei allen Peaks | Kanalbildung in der Säule durch nicht sachgemäße Handhabung (zu hoher pH, zu hoher Druck) | 1. Empfohlener pH- und Druckbereich der Säule beachten 2. Säule austauschen und durch Säule ersetzen, die für den gewünschten pH- und Druckbereich kompatibel ist |
Peak Splitting
Ein Peak Splitting kann unterschiedlich aussehen. Splitten die Peaks nicht sehr stark, kann das Peak Splitting als breiter Peak auftauchen. Auch eine Schulter bei Peaks ist möglich und falls das Problem sehr ausgeprägt ist, können sogar zwei Peaks zu sehen sein. Grund für ein Peak Splitting ist meist ein Totvolumen in der Anlage oder eine zum Teil blockierte Fritte in der Säule und/oder Vorsäule.
| Beobachtung | Mögliche Ursache | Lösung/Vorbeugung |
|---|---|---|
| Peak Splitting bei allen Peaks | Partiell blockierte Fritte in der Säule | 1. Säule umgekehrt Spülen (bitte vorher Herstellerinformationen beachten) 2. Inline Filter verwenden 3. Falls möglich: Inlet Fritte der Säule austauschen (bitte vorher Herstellerinformationen beachten) |
| Peak Splitting bei allen Peaks | Partiell blockierte Fritte in der Vorsäule | 1. Vorsäule austauschen 2. Inline Filter verwenden |
| Peak Splitting bei allen Peaks | Kanalbildung in der Säule durch nicht sachgemäße Handhabung (zu hoher pH, zu hoher Druck) | 1. Empfohlener pH- und Druckbereich der Säule beachten 2. Säule austauschen und durch Säule ersetzen, die für den gewünschten pH- und Druckbereich kompatibel ist |
| Peak Splitting bei früh eluierenden Peaks stärker | Injektionslösungsmittel ist nicht kompatibel mit der mobilen Phase (zu stark oder nicht mischbar) | 1. Mobile Phase als Injektionslösungsmittel verwenden 2. Injektionslösungsmittel verwenden, welches schwächer als die mobile Phase ist |
| Peak Splitting bei einem Peak | Koelution einer Verunreinigung | 1. Probenvorbereitung verbessern |
| Peak Splitting bei einem Peak | Koelution eines zweiten Peaks | 1. Methode optimieren, um Auflösung zu verbessern |
| Peak Splitting bei ionisierbaren Verbindungen (Säure/Base) | pH-Wert zu nahe am pka-Wert der Analyten oder mobile Phase nicht ausreichend gepuffert | 1. pH-Wert 2 Einheiten vom pka-Wert entfernt wählen 2. Pufferkonzentration erhöhen |
Zusätzliche Peaks
Das Problem mit zusätzlichen bzw. unerwarteten Peaks kann verschiedene Ursachen haben. Häufig sind diese Peaks spät eluierende Analyten aus einer vorherigen Probe oder sogenannte Memory-Effekte aus dem Injektionsprozess. Aber auch sogenannte Geister Peaks können Ursache von zusätzlichen Peaks sein oder auch Verunreinigungen in der Probe. Ein anderes Problem stellen sogenannte Spikes dar. Dabei handelt es sich nicht um “breite” Peaks sondern um kurze Ausschläge.
| Beobachtung | Mögliche Ursache | Lösung/Vorbeugung |
|---|---|---|
| Ein oder mehrere zusätzliche Peaks | Verunreinigungen in der Probe | 1. Probenvorbereitungsprozess optimieren |
| Ein oder mehrere zusätzliche Peaks | Verunreinigungen in der mobilen Phase | 1. HPLC-Grade Lösungsmittel verwenden 2. Ghost Guard Säulen einsetzen |
| Ein oder mehrere zusätzliche Peaks | Verunreinigung in der Säule/Vorsäule | 1. Säule spülen 2. Vorsäule austauschen 3. Bei häufigem Auftreten: Methode optimieren/Spülschritt einführen |
| Ein zusätzlicher Peak | Spät eluierender Peak aus vorheriger Probe | 1. Methode für die Probe optimieren 2. Säule nach dem Lauf spülen |
| Zusätzliche Peaks vergleichbar mit anderer/vorheriger Probe | Memory-Effekt aus dem Injektionsprozess | 1. Injektionssystem spülen (Probenschleife, Spritze) 2. Methodenparameter für die Injektion optimieren |
| Spikes | Luft in der mobilen Phase oder im System | 1. Mobile Phasen Entgasen 2. Verschraubungen auf Undichtigkeiten prüfen 3. Ggf. Gegendruckkapillare am Detektor installieren (bitte beachten Sie den maximalen Druck der Detektorzelle) |
| Spikes | Luft in der Säule (Säule nicht mit Endstopfen verschlossen) | 1. Säule immer mit Stopfen lagern 2. Säule spülen |
Negative Peaks
Negative Peaks sind fast immer auf den Detektor zurückzuführen. Dabei zeigt die mobile Phase ein höheres Signal als der Analyt und dadurch entstehen bei der Detektion negative Peaks.
| Beobachtung | Mögliche Ursache | Lösung/Vorbeugung |
|---|---|---|
| Negative Peaks beim RI-Detektor | Refraktiver Index bei Analyt kleiner als der der mobilen Phase | 1. Mobile Phase mit geringerem refraktivem Index verwenden |
| Negative Peaks beim UV-Detektor | UV Adsorption der Analyten kleiner als die der mobilen Phase | 1. Detektionswellenlänge ändern 2. Mobile Phase mit geringerer UV Adsorption verwendet |
| Alle Peaks negativ | Signal Polarität falsch eingestellt | 1. Polarität des Detektors überprüfen |
| Alle Peaks negativ | Kabel des Detektors verkehrt angeschlossen | 1. Verkabelung überprüfen |
Fehlende Peaks
Ein weiteres Problem bei Peaks können vermisste Peaks darstellen. Die Ursachen können ganz einfach sein, wie das falsche Lösungsmittel oder keine Injektion aber auch ein sehr starkes Tailing kann es so aussehen lassen, als würde kein Peak eluieren. Eine Koelution ist ebenfalls vorstellbar falls ein Peak auf einen Parameter wie pH oder Temperatur empfindlich reagiert.
| Beobachtung | Mögliche Ursache | Lösung/Vorbeugung |
|---|---|---|
| Kein Peak eluiert | Falsche Lösungsmittel/mobile Phase | 1. Lösungsmittel und mobile Phase überprüfen |
| Kein Peak eluiert | Es hat keine Injektion stattgefunden | 1. Injektionssystem überprüfen (Dichtigkeit) |
| Kein Peak eluiert | Falsche/keine Probe injiziert | 1. Überprüfen ob das Vial voll genug ist 2. Überprüfen ob richtiges Vial verwendet wurde |
| Kein Peak eluiert | Falsche Säule ausgewählt | 1. Überprüfen der eingesetzten Säule |
| Kein Peak eluiert | Falsche Flussrate an der Pumpe eingestellt | 1. Überprüfen der Flussrate |
| Kein Peak eluiert | Undichtigkeit in der Anlage, wobei die Flussrate dadurch kleiner wird | 1. Verbindungen überprüfen |
| Kein Peak eluiert | Fehlerhafte Probenvorbereitung | 1. Überprüfen ob Probenvorbereitung korrekt durchgeführt wurde |
| Kein Peak eluiert | Detektor falsch eingestellt | 1. Einstellungen des Detektors wie Wellenlänge (UV) oder Modus (negativ, positiv bei MS) überprüfen |
| Ein Peak eluiert nicht | Matrix Effekte interferieren mit der Probe | 1. Probenvorbereitung optimieren 2. Trennmethode optimieren |
| Ein oder mehrere Peaks eluieren nicht | Adsorption im Vial (Wechselwirkung mit Glas) | 1. Polymer Vial oder silanisiertes Vial verwenden |
| Ein oder mehrere Peaks eluieren nicht | Retention der Analyten zu stark | 1. Methode optimieren 2. Säule mit starkem Lösungsmittel spülen |
Retentionszeit Verschiebung
Kommt es zu einer Verschiebung der Retentionszeit, ist es wichtig zu wissen, ob diese Verschiebung nach und nach passiert oder von einem Lauf auf den anderen da war. Dies lässt Rückschlüsse auf die Ursache zu. Eine stetige Verschiebung lässt beispielsweise auf einen Alterungsprozess der Säule schließen. Tritt die Verschiebung plötzlich auf lässt sich dies eher auf ein Problem in der Anlage zurückführen.
| Beobachtung | Mögliche Ursache | Lösung/Vorbeugung |
|---|---|---|
| Retentionszeit nimmt nach und nach ab | Verlust der gebundenen Phase durch zu geringen pH-Wert | 1. Empfohlener pH-Bereich der Säule beachten 2. Säule austauschen oder durch Säule mit anderer pH-Stabilität ersetzen |
| Retentionszeit steigt nach und nach für polare/ionische Verbindungen | Verlust der gebundenen Phase bzw. Endcapping erlaubt vermehrt Wechselwirkung mit Silanolen, geht oft einher mit zunehmendem Tailing | 1. Empfohlener pH-Bereich der Säule beachten 2. Säule austauschen oder durch Säule mit anderer pH-Stabilität ersetzen |
| Retentionszeit variiert beim Einsatz einer neuen Säule | Unterschiede in verschiedenen Lots der stationären Phase (können teilweise recht groß sein) | 1. Überprüfen ob eine Säule aus einer anderen Lot verwendet wurde 2. Bei zu großen Abweichungen ursprüngliche Lot verwenden oder Methode anpassen |
| Retention hat plötzlich ab- oder zugenommen | Änderungen in der Flussrate | 1. Überprüfen ob die richtige Flussrate eingestellt ist 2. Überprüfen auf Lecks im System 3. Überprüfen auf Luftblasen im System |
| Retention hat plötzlich ab- oder zugenommen | Säule mit einer anderen Dimension eingesetzt | 1. Eingesetzte Säule überprüfen |
| Retention hat plötzlich ab- oder zugenommen | Säule wurde überladen und dies führt zu einer gestörten Peakform, wobei auch die Retentionszeit abweicht | 1. Injektionsvolumen und Konzentration überprüfen 2. Eingesetzte Säule überprüfen (Innendurchmesser) |
| Retention hat plötzlich ab- oder zugenommen | Fehlerhafte Zusammensetzung der mobilen Phase | 1. Zusammensetzung der mobilen Phase überprüfen 2. Falls ein Gradientenventil verwendet wird, alle Ventile auf Funktionsfähigkeit überprüfen |
| Retention einer ionisierbaren Verbindung schwankt stark | pH-Wert zu nahe am pka-Wert der Analyten oder mobile Phase nicht ausreichend gepuffert, sodass kleinste Unterschiede im pH-Wert zu großen Änderungen in der Retention führen | 1. pH-Wert 2 Einheiten vom pka-Wert entfernt wählen 2. Pufferkonzentration erhöhen |
| Retentionszeit schwankt von Tag zu Tag oder von morgens zu abends | Temperatur der Säule variiert durch nicht temperieren der Säule | 1. Säulenofen verwenden 2. Säulenofen über Raumtemperatur betreiben, um stabile Retention bei nicht klimatisierten Laboren zu gewährleisten |
| Retentionszeit der neuen Säule weicht von alter Säule ab | Säule ist nicht ausreichend äquilibriert; dies ist vor allem der Fall, wenn TFA in der mobilen Phase eingesetzt wird | 1. Säule länger äquilibrieren (im Falle von TFA auch über Nacht) 2. Bei kurzer Lagerzeit Säule in mobiler Phase mit TFA lagern |
Zu hoher Druck
Ein zu hoher Gegendruck ist ein sehr häufiges Problem in der HPLC und kann vielfältige Ursachen haben. Dabei ist es wichtig zu unterschieden, ob ein zu hoher Druck langsam auftritt oder plötzlich. Ein langsames Ansteigen des Drucks spricht für eine normale Alterung in der Säule/Vorsäule. Sollte der Druck zu hoch sein, kann die Säule gespült bzw. die Vorsäule ausgetauscht werden. Da der Druck sich nur langsam erhöht, ist dieses Problem oft nicht gleich ersichtlich. Bei einer plötzlichen Druckerhöhung ist es ratsam zu überprüfen, ob davor Wartungsarbeiten oder etwas anderes an der Anlage stattgefunden hat. Dies kann Hinweise auf die Ursache geben.
| Beobachtung | Mögliche Ursache | Lösung/Vorbeugung |
|---|---|---|
| Druck baut sich nach und nach auf | Alterung der Säule/Vorsäule | 1. Säule spülen 2. Falls das Spülen keine Verbesserung zeigt, Säule/Vorsäule austauschen |
| Druck ist plötzlich zu hoch | Verstopfte Fritte | 1. Säule umgekehrt Spülen (bitte vorher Herstellerinformationen beachten) 2. Inline Filter verwenden 3. Falls möglich: Inlet Fritte der Säule austauschen (bitte vorher Herstellerinformationen beachten) |
| Druck ist plötzlich zu hoch | Verstopfte Kapillare | 1. Kapillaren systematisch überprüfen |
| Druck ist plötzlich zu hoch | Verstopfter Inline Filter | 1. Inline Filter austauschen |
| Druck ist plötzlich zu hoch | Zu hohe Flussrate | 1. Einstellungen der Pumpe überprüfen |
| Druck ist plötzlich zu hoch | Temperatur zu niedrig, was zu einer höheren Viskosität führt | 1. Temperatur des Säulenofens überprüfen |
| Druck ist plötzlich zu hoch | Puffer/Salz ist ausgefallen | 1. Löslichkeit der eingesetzten Additive vor einer neuen Methode in allen Lösungsmittel Zusammensetzungen prüfen 2. Säule spülen |
| Druck ist plötzlich zu hoch | Falsche Säule (kleinerer Innendurchmesser, länger oder kleinere Partikelgröße) | 1. Eingesetzte Säule überprüfen |
| Druck ist plötzlich zu hoch | Falsche Kapillaren verwendet, kann bei Wartung/Austausch der Kapillaren passieren | 1. Eingesetzte Kapillaren überprüfen 2. Alle Wartungen/Austauscharbeiten dokumentieren |
| Druck ist plötzlich zu hoch | Zu fest angezogene Edelstahlfittings können die Kapillare eindrücken und so eine Engstelle schaffen | 1. Fittinge nach Herstellerangaben festziehen 2. Kapillaren/Verbindungen austauschen |
| Druck ist plötzlich zu hoch | Falsche Lösungsmittel Zusammensetzung | 1. Angemischte mobile Phase überprüfen 2. Bei Gradientenventil Ventile auf Funktionsfähigkeit überprüfen |
Zu niedriger Druck
Ein zu niedriger Duck ist fast immer auf eine Undichtigkeit im System zurückzuführen. Bei einem zu niedrigem Druck sollte daher immer zuerst auf Lecks geachtet werden. Neben Lecks können auch Spülventile das Problem sein, falls diese nach dem Spülen nicht geschlossen wurden.
| Beobachtung | Mögliche Ursache | Lösung/Vorbeugung |
|---|---|---|
| Druck zu niedrig | Leck im System | 1. Lecks suchen und Verbindung ausbessern 1. Kein offensichtliches Leck: alle Verbindungen Überprüfen |
| Druck zu niedrig | Spülventil nicht geschlossen | 1. Spülventil schließen |
| Druck zu niedrig | Rückschlagventil der Pumpe defekt | 1. Rückschlagventil reinigen (Herstellerangaben beachten) 2. Rückschlagventil austauschen |
| Druck zu niedrig | Zu geringe Flussrate | 1. Einstellungen der Pumpe überprüfen |
| Druck zu niedrig | Zu hohe Temperatur, was zu einer niedrigeren Viskosität führt | 1. Säulenofen überprüfen |
| Druck zu niedrig | Kein Lösungsmittel im Vorrat, sodass die Pumpe nichts fördern kann | 1. Lösungsmittelvorrat überprüfen 2. Ggf. Luftblasen aus der Pumpe spülen |
| Druck zu niedrig | Falsches Lösungsmittel mit niedrigerer Viskosität verwendet | 1. Lösungsmittel/mobile Phase überprüfen |
| Druck zu niedrig | Falsche Lösungsmittel Zusammensetzung | 1. Angemischte mobile Phase überprüfen 2. Bei Gradientenventil Ventile auf Funktionsfähigkeit überprüfen |
Basislinien Probleme
Probleme mit der Basislinie (Base Line) können unterschiedliche charakterisiert werden. Zum einen gibt es zufällig auftretende und zum anderen zyklisch auftretende Probleme. Zufällig auftretende Probleme haben meist Verunreinigungen oder Luftblasen als Ursache. Dies kann sich sogar als zusätzlicher Peak in Form von Spikes äußern. Zyklisch oder periodisch auftretende Probleme weisen auf ein Problem mit dem Detektor hin wie z.B. ein Basisliniendrift oder eine Temperaturschwankung.
| Beobachtung | Mögliche Ursache | Lösung/Vorbeugung |
|---|---|---|
| Basisliniendrift | Detektor nicht ausreichend stabilisiert | 1. Detektor mit mobiler Phase spülen, bis stabile Basislinie erreicht wird (insbesondere bei Gradientenmethoden) |
| Basisliniendrift | Gradientenmethode | 1. Manche Detektoren können nicht mit einem Gradienten betrieben werden (z.B. RI-Detektor) 2. Ein gewisser Drift kann bei Gradienten normal sein |
| Basisliniendrift | Verschmutzung in der Detektorzelle | 1. Detektorzelle spülen (Herstellerhinweise beachten) |
| Basisliniendrift | Temperaturschwankungen während eines Laufes | 1. Temperatureinstellungen der Detektorzelle/Säulenofen prüfen |
| Spikes in der Basislinie | Luftblasen im System | 1. System spülen |
| Spikes in der Basislinie | Verunreinigungen in der Säule/mobilen Phase | 1. Säule spülen 2. Mobile Phase neu ansetzen |
| Spikes in der Basislinie | Energie der Detektorlampe nicht mehr ausreichend | 1. Detektorlampe austauschen |
| Starkes Rauschen der Basisline | Empfindlichkeit des Detektors zu hoch eingestellt | 1. Einstellungen des Detektors prüfen |
| Weitere Basislinien Probleme | Problem mit der Elektronik des Detektors | 1. Hersteller kontaktieren |
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