Wässrige Größenausschluss Chromatographie (GFC)

Wässrige Gelfiltrationschromatographie bzw. Size Exclusion Chromatography (GFC bzw. SEC), ist eine analytische Trennmethode zur Charakterisierung makromolekularer Substanzen in wässrigen Medien. Die SEC basiert auf dem Prinzip der molekularen Siebung, wobei die Trennung der Analyten ausschließlich auf physikalischen Größenunterschieden und nicht auf chemischen Wechselwirkungen mit der stationären Phase beruht. Diese Charakteristik prädestiniert die SEC für den Einsatz in der Biochemie, Polymerchemie und anderen Forschungsfeldern, die eine präzise Analyse von Molekülgrößen, molekularen Massenverteilungen und Konformationen erfordern.

 

Lesen Sie die theoretischen Grundlagen der wässrigen Gelfiltrationschromtaographie auf unserer Webseite und finden Sie eine Auswahl an SEC-Produkten von namhaften Herstellern. Sie finden darüberhinaus Broschüren, Kataloge sowie Applikationen zu Proteine, Polysaccharide, Nukleinsäuren und synthetische Polymere unter Einsatz von SEC-Chromatographie-Säulen.

Grundlagen

Stationäre Phasen der GFC/SEC

Die stationäre Phase in der Gel-Filtrations-Chromatographie sind entweder poröse Silica– oder Polymer-basierte Materialien wie Polyhydroxymethacrylat oder Polyvinylalkohol. Um die Adsorption oder andere unerwünschte Wechselwirkungen der Analyten mit den Silica Materialien zu verringern, werden diese meist mit Diol-Gruppen funktionalisiert oder unterliegen während des Herstellungsprozess einer speziellen Behandlung. Als stationäre Phase speziell für Proteine, Antikörper und Enzyme werden die Silica Phasen eingesetzt, da diese eine hohe Auflösung und Wiederfindungsrate aufweisen. Für andere polare Polymere wie z.B. Polyethylenglykol kommen die Polymer-basierten Materialien verstärkt zum Einsatz.

Mobile Phasen der GFC/SEC

Als mobile Phase für die Gel-Filtrations-Chromatographie (GFC) wird hauptsächlich Wasser verwendet. Die GFC dient als Biotrenntechnik zur Trennung von Proteinen und anderen großen Biomolekülen und daher kann ein Einsatz von Puffern oder auch Salzen hilfreich sein. Neben wässrigen Eluenten können zum Teil auch Mischungen aus Wasser und organischen Lösungsmitteln wie Acetonitril und Methanol eingesetzt werden.

Detektoren der GFC/SEC

Für die Gel-Filtrations-Chromatographie können grundlegend die gleichen Detektoren wie in der HPLC verwendet werden. Besonders häufig kommen dabei UV- und RI-Detektoren zum Einsatz. Darüber hinaus werden für die Polymeranalytik auch Lichtstreu- und Viskositätsdetektoren verwendet, um an spezifische Molekül- und Strukturinformationen des Analyten zu gelangen. Wenn die SEC mit Lichtstreuung, Viskosimeter und Konzentrationsdetektoren kombiniert wird (als Dreifachdetektion bekannt), kann sie das absolute Molekulargewicht, die Molekulargröße und die intrinsische Viskosität berechnen sowie Informationen zur makromolekularen Struktur, Konformation, Aggregation und Verzweigung liefern. Um an absolute Molekulargewichte einer Probe zu gelangen, kann der Mehrwinkellichtstreuungsdetektor (Multi Angle Light Scattering Detector, MALS) Verwendung finden. Dieser Detektor hat dabei eine vergleichbare Arbeitsweise wie der einfache Lichstreuungsdetektor.

Referenzmaterialien für GFC/SEC

Durch den Einsatz von Referenzmaterialien mit bekannter Molekülgröße und Molmassenverteilung kann das GFC-System kalibriert werden, um eine präzise Analyse der Molekulargewichte und der molekularen Größenverteilung in einer Probe zu ermöglichen. Kalibrierstandards sind essenziell, um die Leistung der GFC-Anlage regelmäßig zu überprüfen und sicherzustellen, dass die Ergebnisse über die Zeit hinweg konsistent und zuverlässig sind. Diese Standards unterstützen zudem bei der Optimierung von Trennbedingungen und der Verbesserung der analytischen Genauigkeit, was sie zu einem kritischen Bestandteil qualitativ hochwertiger GFC-Analysen macht. MZ-Analysentechnhik GmbH bietet Ihnen ein breites Spektrum unterschiedlicher SEC-Referenzmaterialien von Herstellern wie Sigma Aldrich, Tosoh, Shodex oder Waters an.

Säulen für die SEC/GPC

Für die Auswahl einer geeigneten Säule, sollten zuerst einige grundlegende Fragestellungen geklärt sein.

 

1. Wie ist die Polarität des Analyten beschaffen und welche Lösungsmittel sind dafür geeignet?

Für polare Biopolymere wie Proteine, Antikörper oder Enzyme, werden oft rein wässrige Puffer als Eluenten verwendet. Als geeignetes Basismaterial hat sich dafür Silika-Gel herausgestellt. Für polare bis mittelpolare Polymere werden wässrige oder polar organische Eluenten oder Mischungen aus beiden verwendet. Das Basismaterial ist dabei oft Polymethacrylat oder Polyvinylalkohol. Für unpolare Polymere in rein organische Eluenten dient die Gel-Permeations-Chromatographie meist mit Styrol-Divinylbenzol-Copolymere (PS/DVB) als stationäre Phasen.

 

2. Wie groß ist das Molekulargewicht meines Analyten?

Das Molekulargewicht des Analyten bzw. dessen Größe im Lösungsmittel entscheidet über die Porengröße der stationären Phase. Die absoluten Porengrößen erstrecken sich von etwa 25 bis 30.000 Å, wodurch ein Molekulargewichtsbereich von etwa 100 bis > 20.000.000 Dalton abgedeckt wird. Für Proben mit stark unterschiedlichen Molmassen können entweder mehrere Säulen unterschiedlicher Porenweite hintereinander geschaltet werden oder es werden Säulen verwendet, die Teilchen unterschiedlicher Porengröße enthalten. Diese sind oft mit den Bezeichnungen "linear", "Mixed-Gel" oder "Multipore-Gel" gekennzeichnet.

Mit Hilfe der meist sehr umfangreichen Kalibrierungsdaten der Hersteller, lassen sich in vielen Fällen geeignete Porenweiten problemlos ermitteln.

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