Größenausschluss SEC/GPC

Größenausschlusschromatographie (engl.: Size Exclusion Chromatography, SEC) oder auch Gel-Permeations-Chromatographie (GPC) und Gel-Filtrations-Chromatographie (GFC) genannt, ist ein chromatographisches Verfahren, bei dem die Analyten nach der Größe und Struktur getrennt werden. Anwendung ist die Charakterisierung von natürlichen und synthetischen Polymeren, Biopolymeren, Proteinen und Nanopartikeln.

Die größten Moleküle verlassen die Trennsäule als Erstes. Je kleiner die Moleküle sind, desto besser können sie in die Poren der stationären Phase eindringen und desto später werden sie von der Säule eluiert (Siehe Abbildung).

Grundlagen

Stationäre Phasen der SEC

Als stationäre Phase werden entweder poröse Silica– oder Polymer-basierte Materialien verwendet. Um Adsorption oder andere unerwünschte Wechselwirkungen zwischen Analyt und stationärer Phase zu verringern sind diese noch z. T. modifiziert oder unterliegen während des Herstellungsprozess einer speziellen Behandlung. Polymermaterialien für die GFC basieren meist auf Polymethacrylat oder Polyhydroxymethacylat. Styrol-Divinylbenzol-Copolymer (PS-DVB) wird oft für Polymer-basierte GPC-Säulen verwendet.  

Mobile Phasen der SEC

Bei der Gel-Filtrations-Chromatographie (GFC) werden wässrige mobile Phasen verwendet. Die GFC dient als Biotrenntechnik zur Trennung von Proteinen und anderen großen Biomolekülen. Die Gel-Permeations-Chromatographie (GPC) dagegen wird mit organischen mobilen Phasen gefahren, mit der unpolare Polymere (Kunststoffe) getrennt werden.

Detektoren der SEC

Für die Größenausschlusschromatographie können im Prinzip die gleichen Detektoren wie in der HPLC verwendet werden. Darüber hinaus werden für die Polymeranalytik auch Lichtstreu- und Viskositätsdetektoren verwendet, um an spezifische Molekül- und Strukturinformationen des Analyten zu gelangen. Wenn die SEC mit Lichtstreuung, Viskosimeter und Konzentrationsdetektoren kombiniert wird (als Dreifachdetektion bekannt), kann sie das absolute Molekulargewicht, die Molekulargröße und die intrinsische Viskosität berechnen sowie Informationen zur makromolekularen Struktur, Konformation, Aggregation und Verzweigung liefern.

Referenzmaterialien für SEC

Durch den Einsatz von Referenzmaterialien mit bekannter Molekülgröße und -verteilung kann das GPC-System kalibriert werden, um eine präzise Analyse der Molekulargewichte und der molekularen Größenverteilung in einer Probe zu ermöglichen. Kalibrierstandards sind essenziell, um die Leistung der GPC-Anlage regelmäßig zu überprüfen und sicherzustellen, dass die Ergebnisse über die Zeit hinweg konsistent und zuverlässig sind. Diese Standards unterstützen zudem bei der Optimierung von Trennbedingungen und der Verbesserung der analytischen Genauigkeit, was sie zu einem kritischen Bestandteil qualitativ hochwertiger GPC-Analysen macht. MZ-Analysentechnhik GmbH bietet Ihnen ein breites Spektrum unterschiedlicher SEC-Referenzmaterialien von Herstellern wie Sigma Aldrich, Tosoh, Shodex oder Waters an.

Säulen für die SEC/GPC

Für die Auswahl einer geeigneten Säule, sollten zuerst einige grundlegende Fragestellungen geklärt sein.

 

1. Wie ist die Polarität des Analyten beschaffen und welche Lösungsmittel sind dafür geeignet?

Für sehr polare Biomoleküle, wie Proteine oder Antikörper, werden oft rein wässrige Puffer als Eluenten verwendet. Als geeignetes Basismaterial hat sich dafür Silika-Gel herausgestellt. Für polare bis mittelpolare Polymere werden wässrige oder polar organische Eluenten oder Mischungen aus beiden verwendet. Das Basismaterial ist dabei oft Polymethacrylat oder Polyvinylalkohol. Für unpolare Polymere für dessen Analytik rein organische Eluenten verwendet werden, dienen meist Styrol-Divinylbenzol-Copolymere (PS/DVB) als stationäre Phasen.

 

2. Wie groß ist das Molekulargewicht meines Analyten?

Das Molekulargewicht des Analyten bzw. dessen Größe im Lösungsmittel entscheidet über die Porengröße der stationären Phase. Die absoluten Porengrößen erstrecken sich von etwa 25 bis 30.000 Å, wodurch ein Molekulargewichtsbereich von etwa 100 bis > 20.000.000 Dalton abgedeckt wird. Für Proben mit stark unterschiedlichen Molmassen können entweder mehrere Säulen unterschiedlicher Porenweite hintereinander geschaltet werden oder es werden Säulen verwendet, die Teilchen unterschiedlicher Porengröße enthalten. Diese sind oft mit den Bezeichnungen "linear", "Mixed-Gel" oder "Multipore-Gel" gekennzeichnet.

Mit Hilfe der meist sehr umfangreichen Kalibrierungsdaten der Hersteller, lassen sich in vielen Fällen geeignete Porenweiten problemlos ermitteln.

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