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SEC-GPC Säulen
SEC-Säulen sowie GPC-Säulen für die Size Exclusion Chromatography bzw. Gelpermeationschromatographie dienen zur leistungsstarken Trennung und Charakterisierung von Makromolekülen wie Polymeren und Biomolekülen. Bei MZ-Analysentechnik GmbH bieten wir eine umfangreiche Auswahl an GPC-Säulen sowie SEC-Säulen an, die entwickelt wurden, um Ihnen dabei zu helfen, präzise und zuverlässige Analysen durchzuführen und tiefergehende Einblicke in die Struktur und Eigenschaften Ihrer Proben zu gewinnen.
Unsere hauseigenen MZ-Gel SDplus GPC-Säulen werden weltweit in Analyselaboren seit mehr als 30 Jahren eingesetzt und zeichnen sich durch höhste Qualität zu einem moderaten Preis aus. Die Fertigung der Bulkmedien und Chromatographie-Säulen läuft in unserer eigenen Produktionsstätte unter strengen Qualitätskontrollen ab, um sicherzustellen, dass sie höchsten Ansprüchen gerecht werden. Daneben bieten wir noch GPC- und SEC-Säulen namhafter Hersteller wie Sepax, Tosoh, Shodex und weitere an.
Technische Daten
Welche Parameter beeinfluss wie meine SEC-Trennung?
Verschiedene Parameter haben unterschiedlich starken Einfluss auf eine SEC-Trennung. Die wichtigsten Parameter sind dabei die Porengröße (definiert den Molekulargewichtsbereich) und die Art der stationären Phase (definiert die verwendbaren Lösungsmittel). Dabei ist die erste Wahl bei einer SEC-Trennung die Wahl des Lösungsmittel, das verwendet werden soll bzw. verwendet werden muss. Im folgenden sollen die wichtigsten Parameter einer SEC-Säule genauer beschrieben werden und der Einfluss auf die Trennung berücksichtigt werden.
Einfluss der Säulendimension
Wie beeinflusst die Länge der Säule die Trennung?
Analog zu HPLC-Trennungen wird durch eine längere Säule die Retentionszeit verlängert aber gleichzeitig auch die Bodenzahl erhöht. Mit zunehmender Länge nimmt auch die Beladbarkeit der Säule zu, da mehr Material vorhanden ist. Generell gilt, dass je Länger eine Säule ist …
- desto länger ist die Retentionszeit/Laufzeit.
- desto höher die Bodenzahl.
- desto höher die Auflösung.
- desto höher die Beladbarkeit.
- desto höher der Gegendruck.
Wie beeinflusst der Innendurchmesser der Säule die Trennung?
Der Standarddurchmesser einer SEC-Säule beträgt ca. 8mm und ist größer im Vergleich zu HPLC-Säulen. Dies hat sich etabliert, da die Trennung mittels SEC lediglich auf der Diffusion in die zur Verfügung stehenden Intramolekularvolumen (Partikelvolumen) basiert und Säulen mit größeren Innendurchmesser somit auch eine bessere Trennung liefern. Mit größeren Innendurchmessern stehen somit größere Volumen für die Diffusion zur Verfügung. Für schmälere Säulen wird meist 4.6mm verwendet, wobei auch die Probenmenge dementsprechend reduziert werden sollte. Generell gilt, dass je größer der Innendurchmesser eine SEC-Säule …
- desto tendenziell höher ist die Auflösung.
- desto höher ist die Beladbarkeit.
Wie wähle ich die richtige Kombination aus Länge und Innendurchmesser aus?
Die oben stehenden Erläuterungen zu den Säulendimensionen in der SEC lassen auf eine bevorzugte Dimension schließen. Je länger die Säule, umso höher ist die Auflösung und je größer der Innendurchmesser, desto tendenziell größer wird ebenfalls die Auflösung. Daher hat sich eine Standarddimension von 300x8.0 mm etabliert (manche Hersteller bieten auch einen Innendurchmesser von 7.5 mm, 7.7 mm oder 7.8 mm an). Jedoch sind auch Säulen mit einer Länge von 600 mm von manchen Herstellern erhältlich, wodurch die Auflösung weiter verbessert werden kann.
Da die Selektivität bzw. die Wechselwirkung in der SEC keine Rolle spielt, kann die Auflösung nur verbessert werden, indem entweder andere Parameter wie Temperatur oder Flussrate geändert wird oder die Säule verlängert wird, bzw. eine höhere Bodenzahl erreicht wird. Daher ist es auch üblich mehrere Säulen in Serie zu schalten, um so eine längere Säule zu erhalten.
Wie wähle ich das richtige Packungsmaterial aus?
Zunächst muss dazu die SEC in ihre zwei Teilgebiete unterschieden werden. Kommen wässrige Lösungsmittel zum Einsatz wird allgemein von der GFC (Gelfiltrationschromatographie) gesprochen. Werden organische Lösungsmittel wie THF verwendet spricht man von der GPC (Gelpermeationschromatographie). Die Wahl der Methode hängt dabei ganz von der Löslichkeit der Analyten ab. Je nachdem, welches Lösungsmittel gewählt wird, ergibt sich eine andere Auswahl an möglichen Materialien.
Packungsmaterialien für die GFC
Eine typische Anwendung der GFC ist die Trennung von Proteinen. Für Proteine werden Silica Säulen bevorzugt, da diese eine engere Porengrößenverteilung als Polymere besitzen und zudem druckstabiler sind und in unterschiedlichen Lösungsmitteln nicht quellen bzw. schrumpfen. Durch die engere Porengrößenverteilung kann eine höhere Auflösung in einem bestimmten Molekulargewichtsbereich erzielt werden aber gleichzeitig ist dieser Molekulargewichtsbereich kleiner im Vergleich zu Polymersäulen. Polymersäulen können größere Poren haben als Silica Materialien, sodass für extrem große wasserlösliche Moleküle bzw. Polymere Polymermaterialien eingesetzt werden. Diese sind jedoch nicht so druckstabil und können in verschiedenen Lösungsmitteln quellen und schrumpfen und somit auch die Porengröße ändern. Durch die breitere Porengrößenverteilung sind zudem die Auflösungen schlechter aber es wird ein größerer Molekularbereich abgedeckt.
| Silica | Polymer |
| + Druckstabil | - keine hohe Druckstabilität |
| + enge Porengrößenverteilung für hohe Auflösung | - breite Porengrößenverteilung für geringere Auflösung |
| + Formstabil | - können quellen oder schrumpfen (abhängig vom Lösungsmittel |
| - enge Porengrößenverteilung schränkt Molekulargewichtsbereich ein | + breite Porengrößenverteilung bietet größeren Molekulargewichtsbereich |
| - Porengröße eingeschränkt | + sehr große Poren für große Polymere verfügbar |
Packungsmaterialien für die GPC
In der GPC kommen hydrophobe Packungsmaterialien wie z.B. Polystyrol-Divinylbenzol (PS/DVB) Polymere zum Einsatz. Das gängigste Lösungsmittel ist dabei THF. Jedoch können auch andere Lösungsmittel wie z.B. Chloroform oder DMF eingesetzt werden. Wichtig bei der Wahl der richtigen Säule in Bezug auf das Material ist die kompatibilität des Polymers mit dem gewünschten Lösungsmittel. Nicht jede Säule jeder Porengröße kann mit jedem Lösungsmittel betrieben werden. Daher ist bei spezielleren Lösungsmitteln immer darauf zu achten, ob die ausgesucht Säule auch mit diesem Lösungsmittel betrieben werden darf. Im Zweifel kontaktieren Sie uns! Wir helfen Ihnen gerne weiter.
Wie beeinflusst die Porengröße meine Trennung?
Die Porengröße ist bei SEC-Säulen die wichtigste Größe. Die Porengröße bestimmt den Molekulargewichtsbereich der Säule. In der Regel hat jede Säule einen bestimmten linearen Bereich, in dem Sie eingesetzt werden kann. Dabei gilt, dass je größer die Pore, umso größer ist der Massenbereich und umso höher ist das molekulare Gewicht, das getrennt werden kann. Die Wahl der passenden Porengröße ist dabei abhängig von den erwarteten Massen der Analyten und sollte dementsprechend gewählt werden.
Bei der Auswahl ist es zu empfehlen, den Molekulargewichtsbereich der Säule möglichst klein für die Analyten zu wählen, um die Auflösung zu erhöhen. Falls jedoch sehr kleine und sehr große Moleküle in einem Lauf untersucht werden sollen, gibt es zwei Möglichkeiten:
- Der Einsatz von sogenannten Linear Säulen. Dabei werden Partikel mit unterschiedlichen Porengrößen in eine Säule gepackt, um so den linearen Bereich einer Säule zu vergrößern (dabei ist jedoch die Auflösung recht gering und sollte nur bei sehr stark unterschiedlichen Massen verwendet werden).
- Die Schaltung von mehreren Säulen verschiedener Porengrößen in Serie. Hierbei können Analyten eines großen Massenbereiches mit hoher Auflösung voneinander getrennt werden. Dies wird als Standardmethode in vielen Laboren eingesetzt. Dabei werden die Säulen von kleinen nach großen Poren durchlaufen. Ein Nachteil dieser Methode ist die lange Laufzeit.
Wie beeinflusst die Partikelgröße meine Trennung?
Analog zu den HPLC-Säulen gilt auch bei SEC-Säulen, dass je kleiner die Partikel sind, umso höher ist die Bodenzahl und umso höher ist der Gegendruck. Bei der Wahl der Partikelgröße ist spielt auch die Porengröße eine Rolle. Ab einem bestimmten Punkt ist es nicht mehr möglich kleinere Partikel mit größeren Poren herzustellen. Daher haben Materialien mit großen Poren oft größere Partikel. Ab einem Analyt bzw. Polymergewicht von größer 1.000.000 Da spielen außerdem Scherkräfte eine Rolle. Dabei können die Analyten durch die Kräfte in kleinere Stücke gerissen werden.
Somit empfiehlt es sich große Analyten mit großen Poren und großen Partikeln zu analysieren. Kleine Analyten können mit kleinen Poren und kleinen Partikeln gefahrlos getrennt werden.
Weitere Parameter, die die Trennung beeinflussen können
Andere Parameter haben zwar in erster Linie nichts mit der Säule zu tun aber können die SEC-Trennung dennoch beeinflussen. Die ausgewählte Säule steckt aber den Rahmen ab, in der diese Parameter variiert werden können.
Temperatur
Im allgemeinen spielt die Temperatur in der Selektivität von SEC-Säulen keine große Rolle. So verschieben sich die Peaks bei höheren Temperaturen nur geringfügig. Dafür werden die Peaks aber schmäler, wodurch eine höhere Auflösung erreicht werden kann. Daneben wird auch die Viskosität der mobilen Phase verringert, was zu einem geringeren Gegendruck und somit längeren Lebenszeiten der Säule führen kann.
Flussrate
Da die Trennung hauptsächlich durch Diffusion in die Poren geschieht, kann eine kleinere Flussrate zu schmäleren Peaks führen. Außerdem werden mit einer kleineren Flussrate auch die Scherkräfte reduziert, was zu besseren Analysen für sehr große Analyten führen kann. Da die Diffusionswege bei größeren Partikeln länger sind als bei kleineren, ist der Effekt einer geringeren Flussrate vor allem bei größeren Partikeln spürbar.
Organische Modifier
Organische Modifier in der mobilen Phase werden vor allem bei biologischen Proben eingesetzt, um die hydrophoben Wechselwirkungen zwischen Proteinen und der stationären Phase zu reduzieren. Dadurch werde sekundäre Wechselwirkungen minimiert und die Peaks werden schmäler. Die maximale Konzentration an organischem Modifier in der mobilen Phase ist abhängig von der Stabilität der Analyten und der stationären Phase. Daher sollte die zulässige Konzentration von organischen Lösungsmitteln auf einer Säule vorher nachgeschlagen werden
Im allgemeinen kann die Selektivität einer SEC-Säule schwer beeinflusst werden. Daher ist die Wahl der passenden Säule enorm wichtig. Wir helfen Ihnen gerne bei der Auswahl der besten Säule für Ihre Trennung. Kontaktieren Sie uns! Weitere Informationen zur Trenntechnik können Sie entweder unter Wässrige Größenausschlusschromatographie (GFC) oder Organische Größenausschlusschromatographie (GPC) finden.
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