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Reversed-Phase Chromatographie
Die Reversed-Phase (RP) oder Umkehrphasen Chromatographie ist die am häufigsten angewandte Methode der Flüssigchromatographie. Sie ist gekennzeichnet durch stationäre Phasen mit unpolaren Oberflächeneigenschaften und einer mobilen Phase von polaren Charakter – genau entgegengesetzt zur Normalphasenchromatographie.
Sie finden eine Einführung in die Grundlagen der Reversed-Phase-Chromatographie auf dieser Seite sowie eine Übersicht von HPLC-Säulen passend für diese Trenntechnik.
Gerne helfen wir Ihnen bei der Auswahl der passenden Säule für Ihre analytische Fragestellung.
Technische Daten
Grundlagen
Stationäre Phasen der Reversed-Phase Chromatographie
Als stationäre Phasen werden häufig oberflächenmodifizierte (C30, C18, C8, C4, C1, C6H5,...) Silika-Gele verwendet. Diese können vergleichsweise einfach und in großen Mengen hergestellt werden und besitzen eine hohe mechanische und chemische Stabilität sowie Reproduzierbarkeit.
Weitere Materialien, die als stationäre Phasen der Reversed Phase Chromatographie verwendet werden, sind:
- Hydrophobe Polymere, z. B. Styrol-Divinylbenzol-Copolymer (PS-DVB)
- Modifizierte hydrophile Polymere, z. B. C18-modifizierter Polyvinylalkohol
- Graphitierter Kohlenstoff, z. B. Hypercarb™
- Modifizierte Metalloxidpartikel, z. B. mit Kohlenstoff ummantelte Zirconiumoxidpartikel
Oberflächenmodifizierung von Silika-Gel
Bei der Modifizierung von Silika-Gel, werden die an der Oberfläche vorhandenen Silanole (freie Si-OH Gruppen) mit unpolaren Gruppen chemisch umgesetzt. Bei diesem Vorgang bleiben unvermeidbar immer freie Restsilanole übrig, da es aufgrund von sterischen Gründen nicht möglich ist alle Silanole zur Reaktion zu bringen. Diese Restsilanole führen mitunter zu ungewollten Wechselwirkungen zwischen Analyt und stationärer Phase, was - bei nicht angepassten Bedingungen - zu ungenügender Trennleistung, Adsorbtion oder Peaktailing führen kann.
Neben freien Silanolen können auch Verunreinigungen im Basiskieselgel, z. B. Metallionen, zu unerwünschten polaren Wechselwirkungen führen. Deshalb basieren heutzutage fast alle stationären Phasen auf hochreinem Silika-Gel („Type B Silica“).
Der einfachste Ansatz um den Anteil der Restsilanole zu minimieren ist das sogenannte End-Capping. Dabei werden die verbliebenen Restsilanole mit kleinen Alkylierungsreagenzien, wie z. B. Trimethylsilyl (TMS)-Gruppen umgesetzt. Neben dem gewöhnlichen Endcapping kommen auch noch andere Verfahren zum Einsatz, mit denen vorhandene Restsilanole abgeschirmt werden sollen. Ziel dabei ist immer, dass die Analyten nicht mit freien Silanolen in Kontakt kommen.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Silica-Modifizierung und des darauffolgenden End-Cappings.
Der Trennmechanismus der Reversed-Phase Chromatographie
In der klassischen Reversed-Phase Chromatographie beruht der Trennmechanismus hauptsächlich auf der unterschiedlichen Verteilung der Analyten zwischen der stationären und der mobilen Phase. Dieses Phänomen lässt sich auch als eine Art Extraktion der Analyten zwischen stationärer und mobiler Phase verstehen. Das heißt ein unpolarer Analyt löst sich bevorzugt in der stationären Phase, hält sich dementsprechend bevorzugt dort auf und wird somit langsam von der Säule eluiert. Polare Verbindungen werden hingegen sehr zügig von der Trennsäule gespült, da diese sich bevorzugt in der mobilen Phase aufhalten.
Bei vernachlässigbar kleinen Anteilen von freien Restsilanolen tragen zur Trennung somit nur hydrophobe Wechselwirkungen (Van-der-Waals-Kräfte) bei. In Abhängigkeit von der Silika-Modifizierung können zusätzlich auch andere Wechselwirkungen zur Trennung mit beitragen, z. B. π-π-Interaktionen bei Phenyl-modifizierten stationären Phasen oder schwache Ionenaustausch-Wechselwirkungen bei vorhandensein von freien Silanolen.
Mobile Phasen der Reversed-Phase Chromatographie
Die bei der Reversed-Phase Chromatographie verwendete mobile Phase enthält fast immer Wasser als Komponente mit der geringsten Elutionskraft, und ein mit Wasser mischbares Lösungsmittel, durch das die Elutionskraft der mobilen Phase erhöht wird. Dazu werden meistens Methanol, Acetonitril oder Tetrahydrofuran verwendet, die sich untereinander nicht allein in ihrer Elutionskraft unterscheiden, sondern auch in der Selektivität der Wechselwirkungen, die sie mit den Analyten und der stationären Phase eingehen.
Wie wähle ich die richtige Umkehrphasen-Säule aus?
Die Umkehrphasen Chromatographie (Reversed Phase Chromatography) ist die mit Abstand am meisten eingesetzte Trenntechnik. Daher hat jeder Hersteller eine Vielzahl an unterschiedlichen Modifizierungen und Basismaterialien für die Umkehrphase. Den Einfluss der Porengröße und weiterer physikalischer Eigenschaften ist auf unserer Seite HPLC-Säulen genauer beschrieben.
Durch die Vielzahl an unterschiedlichen Phasen ist die Wahl der richtigen Säule nicht einfach und hängt auch von den Analyten ab. Am einfachsten ist es eine Literaturrecherche bzw. bei Herstellen oder in der Pharmakopoeia nachzuschauen. Hierbei unterstützen wir Sie gerne. Kontaktieren Sie uns!
Es gibt jedoch ein paar Überlegungen, um die Wahl etwas einzugrenzen:
- basische Verbindungen: ein hoher pH-Wert (> 8) der mobilen Phase könnte vorteilhaft sein → Säule mit hoher pH-Stabilität oder Polymer
- saure Verbindungen: ein niedriger pH-Wert (< 1) der mobilen Phase könnte vorteilhaft sein → Säule mit hoher pH-Stabilität
- sehr polare Verbindungen: 100% Wasser in mobile Phase kann notwendig sein oder polare Wechselwirkung → Säule für 100% Wasser, polar modifizierte Säule (polar embedded, polar endcapped)
- sehr hydrophobe Verbindungen: die Retention kann zu lange sein → Säule mit geringerer Kohlenstoffbeladung, mehr Organik in der mobilen Phase
Weitere Parameter können die Trennung ebenfalls beeinflussen. Dazu zählt zum Beispiel die Wahl des Liganden. Dieser kann eine C2 bis C30 Gruppe sein, fluorinierte Phasen, Phenyl-Gruppen, Cyano-Gruppen, polar modifizierte Phasen oder auch encapsulated Phasen (mit einem Polymer auf der Silica Oberfläche). Jede Phase bietet andere Wechselwirkungen, um die Selektivität der Trennung zu beeinflussen.
- C18-Kette: meist verwendete Phase, zeigt gute Retention für eine Vielzahl an Analyten wird meist als erste Phase eingesetzt
- C8-Kette: gleiche Wechselwirkungen wie C18 aber kürzere Retention
- C4-Kette: unpolarer als C8 und mehr polare Wechselwirkung, oft für Proteine und Peptide
- Phenyl: unpolar und Möglichkeit für π-π-Wechselwirkungen, besondere Selektivität für Aromaten
- Cyano: recht polar, Wechselwirkung mit freien Elektronenpaaren, Alternative Selektivität zu C18
- fluorierte Phasen: polar und aromatisch (PFP), Selektivität für halogenierte und polar aromatische Verbindungen
- polar modifizierte Phasen: polar und unpolare Wechselwirkungen, bessere Peakform für saure und basische Analyten, bei 100% Wasser einsetzbar
Hersteller und Säulen für die Reversed-Phase Chromatographie
Mittlerweile haben so gut wie alle Hersteller oder Lieferanten von HPLC-Säulen mehrere Reversed-Phase Säulen im Sortiment. Die Vielzahl an erhältlichen Phasen und Selektivitäten ist dabei enorm. Gerne unterstützen wir Sie bei der Suche und Auswahl einer passenden Säule für Ihre Analytik. Nachfolgend finden Sie eine kleine Auswahl an Reversed Phase HPLC Säulen, die häufig zur Anwendung kommen.
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