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Affinitätschromatographie
Die Affinitätschromatographie ist eine Biotrenntechnik, die unter Anderem für die Reinigung und Analyse von Proteinen, Nukleinsäuren oder Hormonen verwendet wird. Wir haben für Sie eine Auswahl an verfügbaren Affinitätschromatographiesäulen von Marktführern zusammengestellt. Zu den einzelnen Markensäulen der Hersteller Tosoh Bioscience, Shodex, Merck, Separation Methods Technologies (SMT) und Agilent finden Sie weiter unten Informationen zum Basismaterial, Liganden und zu Applikationen. Benötigen weitere Details oder Unterstützung, kontaktieren Sie uns einfach!
Technische Daten
Grundlagen zur Affinitätschromatographie
Bei der Affinitätschromatographie beruht die Trennung bzw. Reinigung einer Substanz auf einer hochspezifischen biochemischen Wechselwirkung des Analyten mit bestimmten Bindungspartnern, die auf der stationären Phase gebunden sind (ähnlich Antigen-Antikörper– oder Enzym-Inhibitor–Wechselwirkung). Dabei wird nur eine Probenkomponente im vorhandenen Substanzgemisch von der stationären Phase festgehalten, während die anderen Moleküle problemlos von der Säule gespült werden können. Am Schluss bleibt die gewünschte Probe auf dem Säulenbett zurück, welche anschließend durch Verdrängung, durch Änderung des pH-Wertes oder durch Änderung der Salzkonzentration eluiert werden kann.
Abbildungen: Schematische Darstellung der Trennung von drei Proteinen mittels Affinitätschromatographie: Bild 1: Nur Protein-2 kann an die Liganden der stationären Phase binden. Die Proteine-1 und -3 können durch Waschen entfernt werden; Bild 2: Nach Elution der Proteine-1 und -3 verbleibt Protein-2 allein auf dem Säulenbett zurück; Bild 3: Protein-2 wird unter geeigneten Bedingungen eluiert.
Wie wähle ich die richtige Affinitätssäule aus?
Wie in den Grundlagen bereits beschrieben, muss die Funktionalisierung der Säule genau zum Ziel Analyten passen, da eine umkehrbare Bindung zwischen der stationären Phase und des Zielanalyten gewünscht ist. Daher ist die Modifizierung der Affinitätssäule das mit Abstand wichtigste Kriterium bei der Wahl der Säule. Da die Zielanalyten vom Liganden unter den Startbedingungen zunächst gebunden und alle Verunreinigungen von der Säule gewaschen werden, sind die Säulen in der Regel kürzer im Vergleich zu anderen Chromtographiearten. Andere Parameter spielen eine eher untergeordnetere Rolle.
Viele rekombinante Proteine besitzen einen Polyhistidin Tag oder einen Gluthathion-S-Transferase (GST) Fusion Tag.
Die Histidin Tags binden an di- oder trivalenten Metallionen. Diese Art der Affinitätschromatography ist als Immobilisierte Metallaffinitätschromatography (IMAC) bekannt. Die gebräuchliste Metall hierfür ist Nickel, aber auch Kupfer, Zink und Cobalt werden verwendet. Zur Elution wird typischerweise Imidazol als kompetitiver Ligand verwendet.
Für GST Fusion Proteine kann ein Tripeptid (Glu-Cys-Gly) als Ligand für die Affinitätschromatography eingesetzt werden. Gluthathion kommt in der mobilen Phase zum Einsatz, um das gebundene Protein zu eluieren.
Ein viel genutzter Ligand in der Affinitätschromatography ist Protein A. Protein A bindet an vielen Immunoglobulins in vielen Spezies. Dies ist ein einfacher Weg um Antikörper aus einer Matrix aufzureinigen. Für die Elution der Antikörper von einer Protein A Säule wird normalerweise eine mobile Phase mit einem niedrigen pH-Wert und einer hohen Konzentration einer Aminosäure wie z.B. Glycin oder Arginin verwendet.
Protein G hat im Vergleich zu Protein A eine höhere Bindungsaffinität. Protein G bindet optimal bei sauren pH-Werten, was die Elution unter saureren Bedingungen (pH < 3) zur Folge hat. Diese hohe Bindungsaffinität kann auch einen IgG Carry over zur Folge haben, weshalb Protein G spezifisch zum Antikörper ausgewählt werden sollte.
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