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Reversed-Phase Chromatographie
Die Reversed-Phase Chromatographie ist gekennzeichnet durch stationäre Phasen, die unpolare Oberflächen-eigenschaften aufweisen. Die mobilen Phasen haben dementsprechend polaren Charakter – genau entgegengesetzt zur Normalphasenchromatographie.

Als stationäre Phasen werden im Allgemeinen folgende Materialien verwendet...

1. Modifiziertes Silica-Gel, z. B. C18-modifiziertes Silica-Gel
2. Hydrophobe Polymere, z. B. Styrol-Divinylbenzol-Copolymer (PS-DVB)
3. Modifizierte hydrophile Polymere, z. B. C18-modifizierter Polyvinylalkohol
4. Graphitierter Kohlenstoff, z. B. Hypercarb™
5. Modifizierte Metallpartikel, z. B. mit Kohlenstoff ummantelte Zirconiumpartikel

...wobei modifizierte Silica-Gele die breiteste Anwendung finden.

Oberflächenmodifizierung von Silica-Gel
Bei der Modifizierung von Silica-Gel, werden die an der Oberfläche vorhandenen Silanole (freie Si-OH Gruppen) mit unpolaren Gruppen chemisch umgesetzt, wie z. B. Alkylketten (Siehe Abbildung1). Bei diesem Vorgang bleiben unvermeidbar immer freie Restsilanole übrig, da es aufgrund von sterischen Gründen nicht möglich ist alle Silanole zur Reaktion zu bringen. Diese Restsilanole führen dann mitunter zu ungewollten Wechselwirkungen zwischen Analyt und stationärer Phase, was - bei nicht angepassten Bedingungen - zu ungenügender Trennleistung, Adsorbtion oder Peaktailing führen kann.


Abbildung 1: Schematische Darstellung der Silica-Modifizierung und des darauffolgenden End-Cappings.
Neben freien Silanolen können auch Verunreinigungen im Basiskieselgel, z. B. Metallionen, zu unerwünschten polaren Wechselwirkungen führen. Deshalb basieren heutzutage die meisten stationären Phasen auf hoch reinem Silica-Gel („Type B Silica“).
Der einfachste Ansatz um den Anteil der Restsilanole zu minimieren ist das sogenannte End-Capping. Dabei werden die verbliebenen Restsilanole mit kleinen Alkylierungsreagenzien, wie z. B. Trimethylsilyl (TMS)-Gruppen umgesetzt. Neben Endcapping kommen auch noch andere Verfahren zum Einsatz, mit denen vorhandene Restsilanole abgeschirmt werden sollen. Ziel dabei ist immer, dass die Analyten nicht mit freien Silanolen in Kontakt kommen.


Worauf beruht die Trennung bei der Reversed-Phase Chromatographie?


In der klassischen Reversed-Phase Chromatographie beruht der Trennmechanismus hauptsächlich auf der unterschiedlichen Verteilung der Analyten zwischen der stationären und der mobilen Phase. Dieses Phänomen lässt sich auch als eine Art Extraktion der Analyten zwischen stationärer und mobiler Phase verstehen. Das heißt ein unpolarer Analyt löst sich bevorzugt in der stationären Phase, hält sich dementsprechend bevorzugt dort auf und wird somit langsam von der Säule eluiert. Polare Verbindungen werden hingegen sehr zügig von der Trennsäule gespült, da diese sich bevorzugt in der mobilen Phase aufhalten (siehe Abbildung).


Abbildung 2: Schematische Darstellung einer mit Alkylketten modifizierten Silica-Oberfläche und Analyten unterschiedlicher Polarität.


Bei vernachlässigbar kleinen Anteilen von freien Restsilanolen tragen zur Trennung somit nur hydrophobe Wechselwirkungen (Van-der-Waals-Kräfte) bei.
In Abhängigkeit von der Silica-Modifizierung können zusätzlich auch andere Wechselwirkungen zur Trennung mit beitragen, z. B. π-π-Interaktionen bei Phenyl-modifizierten stationären Phasen usw.


Welche Lösungsmittel werden als mobile Phasen verwendet?


Die bei der Reversed-Phase Chromatographie verwendeten mobilen Phasen enthalten fast immer Wasser als Komponente mit der geringsten Elutionskraft, und ein mit Wasser mischbares Lösungsmittel, durch das die Elutionskraft der mobilen Phase erhöht wird. Dazu werden meistens Methanol, Acetonitril oder Tetrahydrofuran verwendet, die sich untereinander nicht allein in ihrer Elutionskraft unterscheiden, sondern auch in der Selektivität der Wechselwirkungen, die sie mit den Analyten und der stationären Phase eingehen.


Hersteller von Reversed-Phase HPLC-Säulen

Mittlerweile haben so gut wie alle Hersteller oder Lieferanten von HPLC-Säulen mehrere Reversed-Phase Säulen im Sortiment. Die Vielzahl an erhältlichen Phasen und Selektivitäten ist dabei enorm, sodass heutzutage für praktisch jedes Trennproblem eine geeignete Säule verfügbar ist.

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